© Cemagref, Cirad, Ifremer, Inra, 2006

9782738012272

Le code de la propriété intellectuelle du 1er juillet 1992 interdit la photocopie à usage collectif sans autorisation des ayants droit. Le non respect de cette disposition met en danger l’édition, notamment scientifique. Toute reproduction, partielle ou totale, du présent ouvrage est interdite sans autorisation de l’éditeur ou du Centre français d’exploitation du droit de copie (CFC), 20, rue des Grands-Augustins, Paris 6e.

Analyse du génome et gestion des ressources génétiques forestières

Daniel Prat

P. Faivre Rampant

E. Prado

Avant-propos

Cet ouvrage a été préparé à la demande de la Commission des ressources génétiques pour lui apporter des informations aussi complètes que possible sur l’utilisation des marqueurs moléculaires dans la gestion des ressources génétiques forestières. Les arbres forestiers sont des espèces encore assez peu influencées par l’homme. Leur caractère naturel en fait un matériel de choix pour la mise en place de réseaux de protection des ressources génétiques. L’intérêt de ce document déborde largement les espèces forestières bien qu’elles servent aussi souvent que possible d’illustration.

Les arbres forestiers appartiennent à des groupes taxonomiques différents : les Angiospermes et les Gymnospermes. Ces taxons ont divergé depuis longtemps et possèdent des particularités de leur génome qui sont présentées en préambule aux outils d’analyse du génome.

Les différents types de marqueurs génétiques en usage et d’utilisation prévisible à ce jour sont décrits de façon à présenter leurs avantages et inconvénients ainsi que leurs applications. Les techniques de marquage moléculaire évoluent sans cesse, et aujourd’hui elles tendent à cibler au mieux le gène. Nous avons également inclus les analyses à l’échelle du génome complet qui apportent aussi des informations utiles. Le lecteur pourra ainsi choisir les marqueurs les mieux appropriés à son objectif grâce aux analyses critiques des différents types de marqueurs. Les choix proposés ne sont que des recommandations. Les auteurs se sont attachés à faire le bilan des connaissances et des évolutions prévisibles au moment de la rédaction.

Nous remercions la Direction de l’espace rural et de la forêt qui nous a fourni les moyens d’initier cet ouvrage (convention 61.21.12/97). Nous tenons également à rendre hommage à toutes les personnes qui ont contribué à la préparation de cet ouvrage, en particulier Michel Arbez, Catherine Bodénès, Nathalie Frascaria-Lacoste, Alain Ghesquière, Antoine Kremer, François Lefèvre, Marie-Claude Lesage, Roseline Lumaret, Jean-Claude Mounolou, Rémy Petit, Bernard Romant-Amat, Sylvain Santoni et Giuseppe Vendramin, pour leur soutien à ce projet, pour les informations ou éléments qu’ils ont fournis et pour les améliorations qu’ils ont suggérées. Nous sommes également très reconnaissants à Gerald Tuskan et Stephen DiFazio qui nous ont fait part des données sur le génome de Populus trichocarpa, dont le séquençage est achevé.

L’évaluation des ressources génétiques : l’analyse du polymorphisme

Conservation des ressources génétiques forestières

La protection du patrimoine génétique des espèces végétales est reconnue comme une priorité, soutenue par les instances politiques nationales et internationales, dans un souci de conservation de la richesse génétique, mais aussi de protection de la nature et de l’environnement. Les ressources génétiques ont suscité plusieurs réunions ministérielles internationales. La première réunion gouvernementale internationale importante à l’échelle européenne a été la conférence ministérielle européenne pour la protection des forêts qui s’est tenue à Strasbourg en décembre 1990 et qui a réuni les délégations de 31 pays européens. La deuxième des 6 résolutions porte sur les ressources génétiques forestières : L’ensemble des États d’Europe qui veulent s’associer à une défense commune de la forêt et de son environnement et souhaitent mobiliser les moyens nécessaires, s’engagent à mettre en oeuvre dans leurs pays, selon les modalités qui leur paraissent les plus appropriées, une politique de conservation des ressources génétiques forestières.

La conférence des Nations-Unies sur l’environnement et le développement et la forêt de Rio de Janeiro en juin 1992 a débouché sur une convention portant sur la protection de la biodiversité. La conservation in situ de la diversité biologique y est préconisée (Barthod, 1993). Les États, en fonction de leurs moyens, sont chargés d’élaborer des stratégies, plans ou programmes pour assurer la conservation et l’utilisation durable de la diversité biologique. Ces orientations sont confirmées et précisées dans la résolution H2 de la conférence interministérielle d’Helsinki de juin 1993 (Barthod et Touzet, 1994) et lors des réunions suivantes.

Les autorités politiques sont donc sensibles à la protection des ressources génétiques forestières. En effet, les espèces forestières sont des espèces sauvages qui recèlent encore l’essentiel de leur variabilité naturelle. Il est alors temps de protéger cette ressource que les activités humaines menacent de plus en plus.

Sous la pression démographique l’homme a réduit la surface boisée au profit de l’agriculture et de l’urbanisation. L’activité humaine exerce ainsi une pression sur le milieu environnant qui s’est considérablement accrue au cours des dernières décennies ; cette pression menace l’intégrité de la biodiversité et les ressources génétiques forestières en particulier. L’homme est intervenu aussi sur le milieu forestier par la sylviculture conduite au profit de la production de bois en favorisant souvent un nombre réduit d’espèces au détriment des autres. L’homme a également occasionnellement déplacé des populations et modifié les structures génétiques des massifs forestiers.

D’autres facteurs contribuent à la dégradation de la diversité génétique des espèces forestières : les facteurs environnementaux et notamment les grands changements climatiques, telles les périodes glaciaires qui ont contraint les espèces à se restreindre en populations de faible effectif dans des zones refuges. C’est à partir de ces zones que les espèces survivantes ont recolonisé leur aire de répartition actuelle. Le réchauffement attendu de la planète laisse entrevoir d’autres risques et menaces d’extinction pour diverses espèces vivantes dont des arbres forestiers. Les conditions d’adversité exceptionnelles (pullulation d’insectes ravageurs, prolifération de pathogènes, pollution atmosphérique, etc.), favorisées ou non par l’activité humaine, font peser des menaces sur la survie des populations et des espèces forestières.

L’objectif de la conservation des ressources génétiques forestières est de préserver le potentiel d’adaptation des espèces ou des populations sur le long terme. Les populations doivent donc pouvoir évoluer pour répondre et s’adapter aux changements futurs de leur environnement. Ce ne sont pas tant les peuplements actuels que les générations futures qu’ils engendreront qui sont visés par les mesures de conservation des ressources génétiques. Nos choix doivent être guidés par le succès des générations d’arbres à venir. L’objectif majeur de la conservation des ressources génétiques forestières est de préserver des gènes qui permettront aux populations de faire face aux aléas futurs et inconnus de leur environnement et ainsi de contribuer au maintien des populations et espèces forestières (Arbez, 1994 ; Namkoong, 1995). Les caractères adaptatifs de ces espèces sont donc particulièrement importants. En effet, la longévité de ces espèces expose les populations et les individus aux diverses fluctuations et variations de l’environnement. Le potentiel adaptatif élevé des espèces forestières réside vraisemblablement dans leur forte variabilité génétique (Behm et al., 1997). Cette variabilité doit être préservée afin de maintenir ce potentiel (Gregorius, 1991).

Dans une première étape, les espèces concernées par la mise en place de réseaux de conservation des ressources génétiques forestières sont des espèces de valeur économique ou qui nécessitent des mesures d’urgence. À l’échelle française, les quatre premières sont le sapin pectiné (Abies alba), le hêtre (Fagus sylvatica), l’orme (Ulmus : menace de la graphiose) et le merisier (Prunus avium : risque d’introduction de provenances étrangères appartenant parfois à une autre espèce). Les réseaux européens EUFORGEN se sont focalisés au début sur le peuplier noir (Populus nigra : risque d’introgression par les formes cultivées), des feuillus précieux, le chêne liège (Quercus suber) et l’épicéa commun (Picea abies : menace en Europe centrale) (Turok et Frison, 1995). Les actions de conservation des ressources génétiques forestières se sont ensuite organisées autour de cinq réseaux européens : les feuillus sociaux (Fagus, Quercus), les chênes méditerranéens, les feuillus précieux, les peupliers européens et les conifères. Les réseaux préexistants se sont élargis à d’autres espèces. Ces réseaux sont sous la tutelle d’organismes internationaux (IPGRI, International Plant Genetic Resources Institute). D’autres réseaux existent en Asie-Pacifique (APFORGEN) et en Afrique au sud du Sahara (SAFORGEN, qui se préoccupe aussi d’arbres fruitiers). Pour la plupart de ces espèces, la conservation des ressources génétiques est envisagée in situ, sauf en cas de menace évidente des populations naturelles afin de maintenir sur une longue période un nombre élevé de génotypes et aussi de soumettre ces génotypes aux pressions évolutives naturelles.

La conservation des ressources génétiques a besoin d’une gestion adaptée, elle a aussi un coût économique. Une gestion rationnelle se base sur la connaissance de la diversité génétique de l’espèce, de sa distribution spatiale et dans la mesure du possible, de l’influence des forces évolutives pouvant modifier cette structure dans le temps.

La conservation in situ, qui consiste en la protection des populations dans leur milieu naturel, est largement préconisée pour les espèces forestières en raison de la longue durée de vie des individus, du maintien des pressions évolutives naturelles et d’une plus grande facilité de gestion.

La conservation ex situ, qui consiste au maintien des ressources génétiques en dehors du milieu naturel, prend des formes plus variées (collections d’individus, banques de graines, banques de pollen, banques de tissus, etc.). Elle est conduite lorsque la conservation in situ est trop difficile, comme chez l’orme (menace très forte in situ en raison d’un problème sanitaire). Le renouvellement des générations est alors la principale difficulté. Les règles de gestion de ces collections sont également difficiles à élaborer pour assurer leur entretien et leur pérennité.

Quels sont la taille et le nombre de populations à préserver pour assurer la meilleure représentation de la variabilité génétique existante et garantir au mieux la pérennité des populations ? Comment choisir les populations à préserver ? Comment assurer la régénération de ces populations pour le très long terme ? Telles sont les principales questions posées par la gestion des ressources génétiques. Pour espérer répondre même partiellement à ces questions, il est nécessaire d’évaluer au mieux la variabilité des espèces considérées en s’intéressant aussi à la répartition spatiale. Les pressions évolutives effectives et les menaces qui pèsent sur les populations doivent également être identifiées et estimées.

Avant de décrire les outils permettant l’évaluation de la variabilité génétique et la compréhension des mécanismes qui la régissent, nous présentons ici un état des connaissances sur les génomes des arbres forestiers de façon à mettre en évidence certaines de leurs particularités.

Classification des arbres forestiers

Les espèces forestières appartiennent à deux groupes taxonomiques différents, les Gymnospermes et les Angiospermes. Les Gymnospermes sont d’origine plus ancienne : elles se sont largement développées au Trias et sont probablement apparues au Carbonifère, soit il y a près de 300 millions d’années (Meyer-Berthaud et al., 1999), alors que les Angiospermes ne se sont répandues qu’au Crétacé (Crane et al., 1995), les plus anciens fossiles trouvés datant du Jurassique, soit il y a environ 150 millions d’années (Sun et al., 1998). Les diverses lignées des Angiospermes se seraient différenciées dès l’émergence de ce groupe ; leur berceau se situerait en région tropicale (Barale et Lemoigne, 2000). Les Monocotylédones ont ensuite divergé et se sont diversifiées au début du Crétacé (Bremer, 2000). Les Angiospermes et les Gymnospermes se différencient par de nombreux caractères botaniques et génétiques.

La classification du monde vivant est établie à partir de divers caractères morphologiques qui sont partagés par les espèces voisines. Une proximité génétique est ainsi attendue entre espèces appartenant à des genres ou familles voisins. Cette information sert donc aussi à prédire le transfert éventuel, d’une espèce vers une autre, d’une information génétique telle que l’organisation du génome, la possibilité d’analyser le polymorphisme avec un ensemble de marqueurs génétiques, etc.

La plupart des Gymnospermes sont des plantes ligneuses à port arborescent et produisent donc du bois. Les forêts de Gymnospermes se rencontrent surtout sous un climat tempéré et boréal. Dans les régions tropicales, les Gymnospermes, sont présentes essentiellement en altitude où elles sont fréquemment associées aux Angiospermes. Les espèces forestières gymnospermes, souvent groupées sous le terme de résineux ou de conifères, sont réparties dans quelques familles : les Araucariacées, Céphalotaxacées, Cupressacées, Pinacées, Podocarpacées, Taxacées et Taxodiacées (souvent considérées comme faisant partie des Cupressacées). La famille des Pinacées, particulièrement importante, regroupe la majeure partie des conifères utilisés pour la production de bois. Au sein de cette famille, les données recueillies sur une espèce modèle sont plus facilement transférables aux autres espèces.

Les espèces forestières angiospermes, souvent appelées feuillus par les forestiers, constituent la presque totalité des forêts tropicales et sont aussi très abondantes sous un climat tempéré. Les espèces forestières angiospermes, qui retiennent l’attention de l’IUFRO (International Union of Forest Research Organizations), appartiennent à 117 genres qui se répartissent dans 52 familles. La plupart de ces familles appartiennent aux ordres des Rosales, Célastrales, Fabales, Fagales, Malpighiales, Malvales, Myrtales et Sapindales qui sont classés au sein des Rosidées (fig. 1). Les Rosidées constituent l’une des principales divisions des Eudicotylédones et comportent la majorité des espèces forestières feuillues. Dans ce groupe des Rosidées figurent les Brassicales qui comportent entre autres les Brassicacées avec la plante de référence Arabidopsis thaliana, dont le génome a été entièrement séquencé (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Malgré des traits opposés à ceux des arbres forestiers comme son cycle court (1 mois), son port herbacé, cette espèce au génome de petite taille peut servir de référence à de nombreux arbres forestiers pour un certain nombre de caractéristiques grâce à sa proximité systématique et phylogénétique.

Figure 1 - Position systématique des principales familles comportant des espèces forestières importantes dans la classification des plantes supérieures (d’après Bowe et al., 2000 ; Soltis et al., 2000 ; The Angiosperm Phylogeny Group, 2003).

Organisation des génomes des arbres forestiers

L’activité cellulaire des espèces végétales résulte de l’interaction de trois génomes : le génome nucléaire, le génome chloroplastique et le génome mitochondrial. Ces trois génomes sont caractérisés par leur localisation cellulaire. Chacun de ces génomes possède aussi ses particularités : hérédité, taille, nombre de copies, organisation des régions codantes et non codantes, expression et régulation des gènes, mode d’évolution. Le génome nucléaire est le plus important par la taille et la quantité d’informations. Il est porté par les chromosomes et est présent en deux exemplaires dans les cellules somatiques diploïdes, en plusieurs exemplaires dans les cellules polyploïdes et un seul exemplaire dans les cellules haploïdes (gamétophytes et gamètes). Il est redistribué par recombinaison génétique lors de la méiose. Les génomes chloroplastiques et mitochondriaux localisés respectivement au sein des chloroplastes et des mitochondries sont beaucoup plus petits, le nombre de copies par organite et donc par cellule peut être très élevé (centaines ou milliers de copies par cellules).

Arabidopsis thaliana est la première espèce pour laquelle le génome nucléaire comme les génomes chloroplastiques et mitochondriaux ont été complètement séquencés (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). La comparaison des trois génomes est possible : elle montre des différences importantes sur la taille des trois génomes, leur contenu en gènes, les proportions de base G/C, la présence de pseudogènes (tabl. 1). La proportion du génome occupée par des gènes codant des protéines est faible pour le génome nucléaire (3,9 %) malgré le grand nombre de gènes. C’est le génome chloroplastique qui possède la plus grande part de séquences codantes des protéines (46,0 %). Le génome du riz, Oryza sativa, de 430. 10⁶ pb, est également très largement séquencé (Yu et al., 2002 ; Goff et al., 2002). Des informations provenant des plantes herbacées sont utilisées dans cet ouvrage pour compléter celles souvent moins abondantes venant des espèces forestières.

Un arbre forestier est particulièrement bien connu, il s’agit de Populus trichocarpa dont le génome est maintenant complètement séquencé et en cours d’analyse. Le séquençage de son génome de 480. 10⁶ pb, soit environ quatre fois plus gros que celui d’Ardbidopsis, a été réalisé en moins de deux ans et s’est terminé fin 2004. Les premiers résultats concernant l’ensemble du génome de cette espèce sont utilisés ici (Brunner et al., 2004 ; Sterky et al., 2004, DiFasio et al., 2005). L’analyse des séquences et l’identification des gènes demandent encore du temps pour être achevées. La transcription des gènes doit être confirmée par d’autres analyses moléculaires. Des données sont également disponibles en particulier pour Eucalyptus et Pinus. Les particularités des Populus et Eucalyptus (taille réduite du génome, aptitudes à la multiplication végétative, aptitudes à la transformation génétique, évaluation rapide due à une croissance rapide, intérêt économique) en font un matériel de choix. Diverses informations sur le génome des arbres forestiers sont disponibles sur le site internet Dendrome : http://dendrome.ucdavis.edu/index.html. Des séquences de gènes sont disponibles et peuvent être compareées à d’autres par recherche d’homologie de séquences (site internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/index.html). La taille des génomes chloroplastiques et mitochondriaux des arbres forestiers n’est connue que pour quelques espèces (tabl. 2).

Tableau 1 — Caractéristiques des trois génomes présents chez les plantes, exemple d’Arabidopsis thaliana (d’après Unseld et al., 1997 ; Sato et al., 1999 et The Arabidopsis Genome Initiative, 2000).

Les études de variabilité génétique peuvent porter sur chacun des trois génomes, mais les informations qu’ils apportent ne sont pas équivalentes.

Par convention, les noms des gènes sont écrits en italique, ceux des organites cytoplasmiques commencent par une minuscule, alors que ceux du génome nucléaire commencent par une majuscule (Commission on Plant Gene Nomenclature, 1993).

Tableau 2...